循環性缺氧已被認為(wèi)是多(duō)種肝髒疾病的典型特征，其實時成像對于更好地了解其生物(wù)學(xué)功能(néng)具(jù)有(yǒu)重要意義。例如肝髒缺血再灌注(HIR)是肝髒外科(kē)手術如肝髒移植、肝部分(fēn)切除等過程中(zhōng)經常遇到的生理(lǐ)現象，肝缺血是通過動脈夾夾住小(xiǎo)鼠的肝動脈和門靜脈以導緻約 70％的肝髒血流被剝奪，從而導緻肝髒為(wèi)乏氧狀态，再灌注過程是将鉗夾從血管上釋放出來以恢複血液供應，從而導緻肝髒為(wèi)複氧狀态。近年來，文(wén)獻報道了多(duō)例用(yòng)于診斷肝髒乏氧的敏感型熒光探針，并進一步将熒光成像與光聲成像相結合，以高靈敏度和高組織穿透深度的特點可(kě)視化細胞和組織的形态結構。然而，大多(duō)數乏氧探針是不可(kě)逆的，換言之，探針一旦響應乏氧環境将始終保持熒光“開啓”狀态，不再實時地監測氧氣壓力(pO2)變化，這不可(kě)避免地導緻“假陽性”信号。因此，目前尚缺乏有(yǒu)效的光學(xué)探針用(yòng)于肝髒循環乏氧的可(kě)逆性檢測。

圖1. 探針AzoCy-CF3可(kě)逆性檢測“乏氧-常氧”的反應機制及在肝髒缺血再灌注和非酒精(jīng)性脂肪肝模型中(zhōng)的應用(yòng) (圖片來源：CCS Chemistry)

近期，南京大學(xué)郭子建院士/陳韻聰教授團隊開發了一例新(xīn)穎的近紅外乏氧可(kě)逆探針AzoCy-CF3，如圖1所示，它由熒光報告單元硫雜蒽部花(huā)菁和乏氧識别基團雙三氟甲基芳環偶氮組成。該探針由于偶氮鍵的快速異構化而淬滅熒光，在乏氧狀态下，偶氮鍵還原為(wèi)肼鍵并伴随吸收波長(cháng)紅移，760 nm 處熒光增強96.3倍。AzoCy-CF3探針在體(tǐ)外溶液和細胞中(zhōng)都表現出“乏氧-複氧”環境下的循環可(kě)逆成像，且在肝正常L02和肝癌 HepG2 細胞乏氧狀态下表現出較高的氧含量敏感性，并成功應用(yòng)于荷HepG2小(xiǎo)鼠腫瘤的乏氧監測。進一步将探針AzoCy-CF3應用(yòng)于肝髒缺血再灌注(HIR)模型中(zhōng)，實時“可(kě)逆性”跟蹤 HIR 過程，即在缺血時近紅外熒光/光聲(NIRF/PA)信号增強，再灌注時NIRF/PA信号減弱，如此循環往複。此外，該探針成功可(kě)視化了非酒精(jīng)性脂肪肝(NAFLD)模型中(zhōng)慢性肝髒乏氧的程度，并在體(tǐ)内評估了各種保肝藥物(wù)對NAFLD的治療效果。這種高效的NIRF/PA可(kě)逆型探針為(wèi)建立一個專門用(yòng)于診斷和監測乏氧相關性肝髒疾病的平台提供了一個強大而可(kě)靠的成像工(gōng)具(jù)。相關研究成果發表在CCS Chemistry (DOI: 10.31635/ccschem.024.202404092）。

急性/慢性肝損傷的乏氧可(kě)逆雙模式成像

如圖2所示，AzoCyS-CF3本身吸收峰在625 nm附近，乏氧處理(lǐ)後吸收峰紅移至725 nm，達到光聲成像窗口。AzoCyS-CF3初始态由于偶氮鍵作(zuò)用(yòng)而熒光淬滅，乏氧處理(lǐ)後其760 nm 處的熒光顯著增強；随後将該測試液放置于常氧空氣中(zhōng)，發現其熒光又(yòu)發生了淬滅，再補加小(xiǎo)鼠肝微粒體(tǐ)(内含偶氮還原酶)和NADPH (還原性輔酶)後，熒光重新(xīn)打開；如此數次循環後探針實現了“常氧-乏氧-常氧”條件下熒光“關-開-關”的可(kě)逆響應，光聲信号也實現了類似的變化。AzoCyS-CF3的可(kě)逆行為(wèi)是因為(wèi)探針的偶氮鍵被還原後停留在第一步的苯肼結構，而兩個吸電(diàn)子基三氟甲基可(kě)以穩定苯肼狀态，使其不會繼續被還原，在氧氣存在時，苯肼将電(diàn)子傳遞給氧氣，自身被氧化成初始态偶氮鍵。同時，熒光強度-時間曲線(xiàn)圖表明該響應平衡時間為(wèi)20分(fēn)鍾且增強幅度達到 96.3 倍，相比之前的工(gōng)作(zuò)在光譜響應性能(néng)上有(yǒu)很(hěn)大的進步。

圖2. 探針AzoCyS-CF3可(kě)逆響應“乏氧-複氧”環境的NIRF/PA光譜圖 (圖片來源：CCS Chemistry)

據文(wén)獻報道，腫瘤組織是常見的乏氧環境，其原因是腫瘤細胞快速地生長(cháng)，消耗氧氣和其他(tā)養分(fēn)，而内部血管的生長(cháng)速度相對較慢，導緻血流量減少，供氧能(néng)力大大削弱，使得局部腫瘤組織形成乏氧區(qū)域。如圖3所示，在活體(tǐ)腫瘤模型中(zhōng)研究了探針AzoCyS-CF3在體(tǐ)内的乏氧識别性能(néng)。熒光成像顯示左側皮下注射組熒光略有(yǒu)增強，而右側瘤内注射組熒光在1 h内大幅度增強至3.7倍，且從小(xiǎo)鼠全身圖中(zhōng)也能(néng)看出熒光信号強弱的明顯差異。這表明 AzoCyS-CF3可(kě)以在腫瘤部位乏氧環境特異性激活。進一步采集左側皮下和右側腫瘤的 730 nm處光聲信号，由圖可(kě)見，腫瘤中(zhōng)光聲信号顯著增強，而皮下注射組的信号幾乎沒有(yǒu)明顯變化，通過 3D 重建獲得三維組織圖像，再将三維圖沿 X 軸進行分(fēn)割，得到一系列的組織深度成像圖。可(kě)以看出在健康的皮下組織中(zhōng)，随着組織深度的變化，PA730 光聲信号幾乎沒有(yǒu)變化，說明正常組織沒有(yǒu)乏氧的特征。相比之下，腫瘤中(zhōng)的光聲信号強烈且主要集中(zhōng)在内部，腫瘤邊緣的信号較弱，說明實體(tǐ)瘤中(zhōng)氧含量分(fēn)布高度不均勻，其内部由于血管供氧速度遠(yuǎn)低于腫瘤生長(cháng)速度而導緻嚴重乏氧。以上方法和結果表明 AzoCyS-CF3可(kě)以精(jīng)确區(qū)分(fēn)腫瘤乏氧異質(zhì)化，為(wèi)可(kě)視化測定乏氧程度和輔助癌症治療提供有(yǒu)力的分(fēn)子工(gōng)具(jù)。

圖3. 探針AzoCyS-CF3用(yòng)于腫瘤乏氧熒光/光聲雙模式成像 (圖片來源：CCS Chemistry)

肝髒缺血再灌注(HIR)是肝髒外科(kē)手術過程中(zhōng)經常遇到的生理(lǐ)現象，該行為(wèi)會産(chǎn)生高度的氧化應激和典型的急性肝損傷，同時這種缺血-供血過程無法避免地導緻肝髒經受循環乏氧-複氧曆程。探針AzoCyS-CF3具(jù)有(yǒu)肝髒代謝(xiè)和保留的能(néng)力，選取在尾靜脈注射探針2 h後進行HIR 手術并跟蹤成像(λex: 740 nm，λem: 790 nm±20 nm)，且整個過程在三個小(xiǎo)時内完成，這樣可(kě)避免由代謝(xiè)和濃度引起的熒光變化。如圖4所示，尾靜脈注射 AzoCyS-CF3後 2 h，立即手術缺血，以注射後2 h為(wèi)零點，熒光強度在前20分(fēn)鍾迅速增強至2.5倍，并在接下來的20 分(fēn)鍾内保持不變；40分(fēn)鍾後去掉動脈夾，恢複血液供應，此時熒光強度迅速降低，20分(fēn)鍾後降低至最低值并幾乎變化。以注射後2 h為(wèi)零點，整個熒光變化過程可(kě)以總結為(wèi)：增強(缺血開始，前 20 min)-平台(20 min~40 min)-降低(灌注開始，40 min~60 min)-平台(60 min~80 min)，光聲信号亦達到了類似的響應。因此，探針AzoCyS-CF3能(néng)實時跟蹤HIR手術中(zhōng)乏氧-複氧過程，且響應時間為(wèi)20分(fēn)鍾，具(jù)有(yǒu)手術導航的潛在作(zuò)用(yòng)。

圖4. 探針AzoCyS-CF3用(yòng)于肝髒缺血再灌注模型中(zhōng)熒光/光聲雙模式成像 (圖片來源：CCS Chemistry)

非酒精(jīng)性脂肪性肝病(NAFLD)是目前全球最常見的慢性肝病，可(kě)從肝髒脂肪變性發展到肝硬化。在高脂飲食(HFD)的小(xiǎo)鼠中(zhōng)，慢性缺氧已被确定與NAFLD的發病機制有(yǒu)關，然而，目前很(hěn)少有(yǒu)研究通過監測體(tǐ)内乏氧程度來評估保肝藥物(wù)的療效。如圖5所示，根據不同的結構類型篩選了6種保肝藥物(wù)，即奧貝膽酸(OCA)，奧利司他(tā)(ollistat)，己酮可(kě)可(kě)堿(PTX)，N-乙酰半胱氨酸(NAC)，硫辛酸(α-LA)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，用(yòng)以研究探針在 NAFLD小(xiǎo)鼠模型的乏氧程度雙模式成像來評估其療效。按照标準程序，用(yòng)HFD喂養小(xiǎo)鼠8周，建立 NAFLD 動物(wù)模型。随後将小(xiǎo)鼠随機分(fēn)為(wèi)正常對照組(NC)、HFD組(HFD組)和康複組(分(fēn)别給予6種藥物(wù)飲食)。通過尾靜脈給小(xiǎo)鼠注射AzoCys-CF3，并進行時間依賴性熒光成像，研究發現，對于HFD小(xiǎo)鼠組，肝髒區(qū)的熒光信号比NC組強約2.6倍，而康複組表現出比HFD 組更弱的熒光信号。顯然，SAM組和OLST組的肝熒光下降較為(wèi)明顯，分(fēn)别比HFD組低42%和54%。從不同小(xiǎo)鼠組獲得的主要解剖器官的熒光圖像與體(tǐ)内熒光圖像一緻。光聲信号的變化趨勢與熒光成像結果一緻。并且可(kě)通過血清生化标志(zhì)物(wù)如谷丙轉氨酶(ALT)，天冬氨酸氨基轉移酶(AST)，γ-谷氨酰胺酰基轉移酶(γ-GGT)和肝髒H&E染色組織病理(lǐ)學(xué)檢查來評估肝損傷程度，這些生化指标檢測結果與利用(yòng)乏氧水平作(zuò)為(wèi)生物(wù)标志(zhì)物(wù)的體(tǐ)内 NIRF/PA 成像的表現非常一緻。這些結果證實 AzoCys-CF3可(kě)作(zuò)為(wèi)一種有(yǒu)效的NIRF/PA雙重成像試劑，用(yòng)于監測慢性肝缺氧和評估保肝藥物(wù)對NAFLD的治療效果。

圖5. 探針AzoCyS-CF3用(yòng)于NAFLD小(xiǎo)鼠慢性缺氧模型的體(tǐ)内檢測及藥物(wù)保肝作(zuò)用(yòng)的評價 (圖片來源：CCS Chemistry)

該工(gōng)作(zuò)提供了一例可(kě)靠的雙模式成像試劑AzoCyS-CF3，用(yòng)以可(kě)視化肝髒循環缺氧曆程和慢性肝疾病康複評估，這對研究循環乏氧相關性疾病的病理(lǐ)進展具(jù)有(yǒu)重要意義。

相關研究成果發表在CCS Chemistry (DOI: 10.31635/ccschem.024.202404092），南京大學(xué)博士後姚善昆為(wèi)第一作(zuò)者，郭子建教授、陳韻聰教授為(wèi)通訊作(zuò)者。詳見：Shankun Yao, Zelong Wu, Yuming Zhang, Tao Yang, Hao Yuan, Weizhong Ding, Weijiang He, and Zijian Guo* & Yuncong Chen*. Dual mode reversible imaging of the hypoxia status of acute and chronic hepatic injury. DOI: 10.31635/ccschem.024.202404092.

轉載鏈接：南京大學(xué)郭子建/陳韻聰教授團隊：急性/慢性肝損傷的乏氧可(kě)逆雙模式成像 (qq.com)

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